黄芪多糖提取技术

众所周知，黄芪具有补气固表、利尿排毒、排脓、敛疮生肌的功效，主产于甘肃、内蒙、陕西、河北及东北、西藏等地。黄芪多糖自1981年被提取分离以来，研究与应用报道逐渐增多，许多学者在研究黄芪多糖组成、结构和生物活性的同时，对其提取分离工艺进行了研究，探索发现出了一些新的提取分离方法。

一、蒸馏水提取法 

由于黄芪多糖是溶解于水而不溶解于醇的大分子化合物，所以目前黄芪多糖的提取主要采用蒸馏水提取工艺，即将黄芪根粉碎后加于蒸馏水中煮沸，使黄芪多糖溶解于水，合并滤液浓缩后调pH为中性，用乙醇将多糖从提取液中沉淀分离，丙酮洗涤，经过冷冻和真空干燥后得到粗多糖。这种提取方法工艺简单，操作简便易行，但是对提取物的选择性不好，可把黄芪中的黄酮、皂甙等同时提取出来，而在后续工艺中又不容易将它们分离出来。蒸馏水提取法水煮温度高达100℃，提取成本高，并且多糖粗品收率低，约为2.5%左右，严重制约了黄芪多糖的研究与开发。

通过对黄芪多糖水煎提取工艺优化试验研究表明，多糖含量随因素变化差别较小，而收率差异明显。加12倍量水，提取3次，每次1.5小时为最佳工艺，其中多糖的得率为2.0%，总多糖含量为37.5%；研究得出提取黄芪中多糖的最佳方法为用80%乙醇溶液，固液质量比为1：60，于90℃水浴提取，多糖粉得率.94%，其中水溶性多糖的含量为58.6%； 研究水煎法提取黄芪多糖表明，最佳提取时间为60分钟，提取温度为100℃，溶比1：6，提取两次黄芪多糖的最高含量达6.75微克/毫升； 改进了传统100℃水煮醇沉法从黄芪中提取多糖的方法，在适当的温度（62~68℃）进行提取，避免将多种物质同时提出，使提取物的组成单一，第一次提取物的纯度能达到96%以上，且外观为白色，再经一次提纯后纯度可达到99%以上，黄芪多糖提取率为8.2%； 研究发现，黄芪多糖较佳的提取工艺为加12倍量水，提取3次，每次1小时，经过验证试验表明，此工艺稳定、合理、可行； 通过正交试验得到黄芪多糖最佳提取工艺为，先用10倍量水浸泡0.5小时，煎煮1.5小时；第2次加8倍量水，煎煮1.0小时；第3、4次各加6倍量水，煎煮时间为1.0小时； 采用温浸法优化了试验，最佳提取黄芪多糖工艺为料液比1：6，提取时间90分钟，提取温度100℃时提取3次；采用乙醇沉淀法，分离的最佳工艺是乙醇浓度为90%，加入量为5倍体积，沉淀时间为4小时；确定最佳纯化工艺为AB28大孔吸附树脂吸附，30%乙醇洗脱。

二、碱水提取法 

黄芪多糖是极性大分子化合物，作为黄芪纤维质的组成部分，其提取收率取决于黄芪纤维质的溶胀作用和溶解性，而纤维在碱中的溶胀作用和溶解性比水中均显著增加。同时在碱性条件下纤维之间的酯键易断裂而发生剥皮反应，使更多的多糖得以游离而被提取出来，从而提高多糖收率。因此黄芪多糖多采用不同温度的水和弱碱溶液提取，尽量避免在酸性条件下提取。

采用CaO水溶液提取和Na2CO3水溶液提取法制备黄芪多糖粗提物，结果发现，CaO水溶液提取收率最高（11.7%），是水提取法收率（3.6%）的3.25倍，其黄芪多糖含量为89.1%，是Na2CO3水溶液提取收率（5.17）的2.05倍，后者黄芪多糖含量为88.0%，而且成本也下降不少；采用醇碱提取法提取黄芪多糖，通过单因素实验设计分别研究了提取溶剂pH值、料液比、提取时间、提取温度和提取溶剂乙醇浓度5种因素对黄芪多糖提取率的影响，利用紫外分光光度法和红外光谱法对醇碱提取法提取黄芪多糖的含量进行检测，计算黄芪多糖的提取率为19.15%，分别是水提取法和碱提取法的3.53倍和2.63倍，残渣中有效成分的残留量低于其他两种提取方法； 通过研究筛选出碱水提取法最佳提取工艺为1：12水浴比、70℃温度、90%乙醇醇沉1次、pH=10的条件下提取3次，黄芪多糖的最高提取率为19.2%； 用水提醇沉法和碱醇提取醇沉法提取黄芪多糖，并用3种不同的天然澄清剂对提取液做纯化处理，结果表明，碱醇提取醇沉法所的黄芪多糖的提取率和多糖含量优于传统的直接水提醇沉法，提取率是传统方法的2倍，含量为传统方法的5倍多； 采用水提取法、CaO溶液提取法提取黄芪多糖并测定含量，结果水提取法黄芪多糖平均收率为3.8%，平均含量为66.37%；CaO溶液提取法黄芪多糖平均收率为7.05%，平均含量为82.09%，因此，采用CaO溶液提取法比水提取法可以提高黄芪多糖收率和含量。

三、微波提取法 

微波技术应用于植物细胞壁，其热效应能使细胞壁破裂，细胞膜中的酶失去活性，细胞中的多糖很容易突破细胞壁和细胞膜障碍而被提取出来，有效地提高了多糖收率。微波对黄芪多糖的提取具有很好的辅助作用，能降低提取剂用量，缩短提取时间和提高多糖产率，具有省时、高效、节能等优点。 运用微波技术对黄芪用石油醚、乙醚去脂溶性杂质，用80%乙醇提取除去间糖、低聚糖及甙类等干扰性成分后，再运用微波技术用水提醇沉法制得黄芪粗多糖，测得黄芪中多糖含量6.55%，平均回收率为99.05%； 采用微波辅助提取黄芪多糖，产率为146%，纯度为88.1%。与直接加热法相比，微波辅助提取能缩短提取时间，降低提取剂量，提高产率； 以黄芪多糖的提取率为考察指标，采用正交试验，研究黄芪多糖的超声辅助提取工艺，结果确定的优化条件为固液比为30∶1，超声波强度120W提取时间1小时，其最佳工艺的提取率达到92.1%。认为与直接加热提取法相比，微波提取省时、节能，提取率高。

四、超声波提取法 

利用超声波的机械破碎和空化作用，可加速溶剂穿透组织作用，释放内容物，提高中草药有效成分的提取率。具有节省溶剂用量、缩短提取时间、降低能耗的优点。 

应用超声细胞粉碎与水煎煮、稀碱浸提法分别提取黄芪多糖，比较3种方法获得的多糖纯度，结果超声细胞粉碎提取得到的黄芪多糖纯度最高，水煎法次之，碱提法最差；采用超声波提取技术从黄芪中提取黄芪多糖，分别考察了乙醇用量、超声波频率、浸提时间、固液比、提取液pH值等因素对多糖提取量的影响，并通过正交试验得到了超声波提取黄芪多糖的最佳工艺参数为超声波频率为14kHz，提取时间为15分钟，固液比为3∶80(克∶毫升)，提取液pH值为8.5，在此条件下，黄芪多糖的提取量为6.223毫克/克； 采用超声波法提取黄芪多糖，单因素试验考察了提取时间、料液比、温度、pH值对黄芪多糖提取率的影响，并通过正交试验优化了提取黄芪多糖的工艺条件，结果表明，超声波法提取黄芪多糖的最佳条件为时间20分钟/次，提取次数2次，料液比1∶12，pH值9，温度80℃，黄芪多糖的提取率高达96.6%，是直接加热法的2.5倍； 以黄芪根粉为材料，用超声波法提取其中的黄芪多糖，考察提取时间、超声功率和提取温度对提取液中黄芪多糖含量的影响，并采用均匀设计对提取条件进行优化，结果提取时间、超声功率和提取温度对提取液中黄芪多糖含量的影响由大到小依次为超声功率>提取温度>提取时间；根据多糖含量与超声功率、提取温度和提取时间的回归关系，预测黄芪多糖的最佳提取条件为:提取时间100分钟、超声功率250 W、提取温度80℃；当超声功率为250 W、提取温度为80℃、提取时间分别为70、80、90分钟时，黄芪多糖含量分别为8.38%、8.41%和8.38%。 

五、酶提取法 

近年来酶技术应用于中草药有效成分的分离提取取得了不少新的成果，酶法用于中草药有效成分的提取呈增加趋势，通过选用合适的酶制剂能够提高皂苷类、蛋白类、黄酮类以及多糖类等活性成分的得率。 

采用纤维素酶提取黄芪多糖，通过正交试验确定了酶解的最佳条件为120分钟，酶用量0.8%，酶解温度75℃，提取多糖含量为9.78%，总糖含量为50.2%，与传统水煮醇沉法相比，黄芪多糖的提取率有较大提高；为了提高黄芪有效成分的提取率，分别用0.3%、0.4%和0.5%纤维素酶预处理后用常规水提取法，结果表明，黄芪有效成分的提取中加入不同浓度的纤维素酶，能显著提高黄芪甲苷和黄芪多糖的收率，其中黄芪多糖的收率较对照组分别增加了 314.8 %、392.6 %、342.6%，黄芪甲苷的收率分别增加了83.4 %、61.8 %、56.8 %； 以提取液的总糖和还原糖为考察指标，通过不同提取方法提取多糖及扫描电镜分析，探讨纤维素酶处理对黄芪多糖提取效果的影响，结果纤维素酶处理条件的优化为纤维素酶加入量为60单位/克生药，酶处理时间为90分钟，温度50℃；与对照工艺相比得率由24.4%提高至30.3%，增加率为24.2%，而多糖的质量分数基本不变。扫描电镜观察表明，纤维素酶明显地分解了黄芪原料中的部分结构多糖，药渣中的网状结构变得十分清晰； 运用Box-Behnken中心组合响应面分析法优化纤维素酶法提取黄芪多糖的工艺条件，探讨了酶解过程中酶解pH值、温度和加酶量对多糖提取含量的影响，优化工艺方案为:酶解pH4.0，温度56.5℃，加酶量61单位/克，其多糖的平均含量达到20.31%； 采用超声联合酶法对黄芪总多糖进行有效提取，通过单因素实验考察超声提取时间、超声提取温度、固液比及酶用量对黄芪总多糖提取率的影响，并运用正交试验优化其提取工艺，结果影响黄芪总多糖提取率的因素按大小次序排列为:超声提取时间>超声提取温度>酶量>固液比，优化工艺参数为:超声提取时间30分钟、超声提取温度40℃、固液比1∶20(克∶毫升)、酶量10毫克。 与黄芪多糖的传统水提工艺相比，采用超声联合酶法进行提取，黄芪多糖的提取率明显提高，优选得到的工艺稳定可行。 

综上所述，各种提取黄芪多糖的方法各有优缺点，要想获得更纯的黄芪多糖提取物及更高的提取率，还需要在综合各种现有方法的基础上改进或探寻新的方法，以适应黄芪的产业化及大规模生产应用。

豆科岩黄芪属植物，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌之功能。现代药理研究证明其有强心、利尿、降压、护肝、抗肾炎和提高免疫等作用。该属植物化学成分较复杂，其中具有生物活性的成分有多糖、木质素类、黄酮类化合物、香豆苯醚类、生物碱类、皂苷类、甾体类、氨基酸、微量元素等众多的生物活性物质。

天山岩黄芪Hedysarum semenovii Regelet Herd为豆科Leguminosea岩黄芪属Hedysarum Linn.植物，分布于新疆乌鲁木齐、伊犁、阿勒泰、塔城等地区，经过调研和文献查新得知，对天山岩黄芪中多糖的提取及含量测定未见报道。因此，为了资源开发，我们首次对天山岩黄芪中多糖的提取及含量测定进行研究。

多糖不仅是机体的重要组成部分，还具有提高机体免疫 、抗菌、抗病毒、抗衰老 、抗肿瘤、抗突变、降血脂、降血糖、防辐射以及改善动物生产性能等多种生物活性，同时由于它自身对细胞毒性极小，对正常细胞影响很小，因此多糖作为药物对于治疗多种免疫缺损疾病和自身免疫疾病有显著的效果。为此，我们采用可见分光光度法对天山岩黄芪根中多糖的含量进行了测定，为今后进一步地研究、开发该药用植物资源提供参考。

1 材料与试剂

1.1 样品来源天山岩黄芪6月份采自新疆乌鲁木齐东山区，采后洗净，晾干，60℃烘干，粉碎后过60目筛备用。

1.2 仪器与试剂SX721分光光度计上海第三分析仪器厂，紫外分光光度仪，超声仪SK8210HP，水浴锅，酒精计，漏斗，分液漏斗，无水葡萄糖，苯酚分析纯，浓硫酸，95乙醇，氯仿，正丁醇，活性碳。

2 方法与结果

2.1 多糖的提取与精制天山岩黄芪根粉100 g加水适量超声提取3次，30 min/次，过滤，合并滤液，浓缩，加95醇至含醇量为80 ，静置过夜（4℃），过滤，分离出沉淀，加适量水溶解，加95醇至含醇量为80 ，再静置过夜（4℃），过滤，分离出沉淀，加水溶解，除蛋白（氯仿∶正丁醇4∶1），共除20次，加活性炭脱色，抽滤，加95醇至含醇量为80，静置过夜（4℃，过滤，分离出沉淀，冷冻干燥得多糖（0.505 1g），密封备用。

2.2 溶液的制备

2.2.1 葡萄糖标准溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1 g，置100 mg容量瓶中，加蒸馏水至刻度，再精密吸取10 ml于另一容量瓶中，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用，得0.1 mg/ml的葡萄糖标准溶液。

2.2.2 苯酚溶液的制备称取苯酚100 g，加锌片0.1 g，NaHCO3 0.05 g，蒸馏，收集182℃馏分，称取此馏分5 g，加蒸馏水95 ml，置棕色瓶中备用，得浓度为5的苯酚溶液。

2.2.3 天山岩黄芪多糖液的制备精密称取干燥至恒重的天山岩黄芪多糖0.1g，置100mg容量瓶中，加蒸馏水至刻度，再精密吸取10ml于另一容量瓶中，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用，得0.1mg/ml的天山岩黄芪多糖溶液。

2.3 最大吸收波长的选择分别配制0.1 mg/ml的葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、醛糖溶液，分别精密吸取1 ml于具塞试管中，分别加苯酚试液1 ml，摇匀，迅速加浓硫酸5 ml，振摇2 min后，旋转于沸水浴中加热15 min，取出置冷水中冷却置室温，以苯酚-浓硫酸溶液为空白，用紫外分光光度仪在400800 nm范围内，扫描光谱图，得上述糖溶液的最大吸收分别为486，488，479，488，479 nm。以同样的方法处理天山岩黄芪多糖样品溶液，在486 nm处有最大吸收。

2.4 葡萄糖标准曲线的绘制分别精密吸取配制的0.1 mg/ml的标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml于具塞试管中，分别加蒸馏水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0 ml，分别给试管编号。分别加苯酚试液1 ml，摇匀，迅速加浓硫酸5ml，振摇2 min后，旋转于沸水浴中加热15 min，取出置冷水中冷却置室温，以苯酚-浓硫酸溶液为空白，于486 nm处测吸光度得回归方程A51.654C0.037 2，r0.999 8（n5），线性关系较好。

2.5 测定换算因子f精密称取已干燥至恒重的天山岩黄芪多糖4.048 mg于100 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得多糖供试品溶液。精密吸取该溶液2 ml，按“标准曲线”项下操作，测定486 nm处的吸光度为2.932 2，由回归方程计算供试品中葡萄糖的含量为0.056 mg/ml，按下式计算f。fw/c式中w为供试液中天山岩黄芪多糖的量（4.048 mg），由公式得f3.614（n3）。

2.6 样品中多糖的含量测定精密称取样品1 g于100 ml容量瓶中，加水适量，80℃超声提取30 min，加水至刻线，吸取2 ml于具塞试管中，按“标准曲线”项下的操作，测定486 nm处的吸光度。多糖（）CDf/w×100（C：样品溶液中葡萄糖的浓度；D：样品溶液的稀释倍数；f：换算因子；w：样品的质量；），由公式得多糖平均含量为7.35。

2.7 精密度实验精密吸取葡萄糖对照品溶液（0.1 mg/ml）0.4 ml，5份，天山岩黄芪多糖供试液（0.1 mg/ml）0.4 ml，5份，按“标准曲线”项下的操作，分别测定486 nm处的吸光度，计算得RSD1 1.28，RSD21.50。 3 讨论 通过对天山岩黄芪根中多糖的含量测定，可知其中多糖含量在5.23～9.13之间，可见用分光光度法测定天山岩黄芪根中多糖的含量是可行的。本方法稳定可靠，简单易行。本实验可为天山岩黄芪的产品开发提供一定的理论依据。

黄芪多糖有广泛的药理作用，能明显提高人体免疫力，久病患者服用，能加快身体康复，可加快肝损伤患者的恢复。近年来，黄芪多糖显著的抗癌作用更日益引起医药界的广泛关注。该技术从黄芪及黄芪下脚料提取黄芪多糖，所得黄芪多糖提取物分一次提取物(NGF)和二次提取物(NGS)两种。技术指标如下：NGF：易溶于水的白色粉末；水不溶物含量1.5-3.5%；熔点：高于290℃；不溶于酒精等有机溶剂；纯度：96-98%。NGS：易溶于水的白色粉末；水不溶物含量0.1-0.2%；熔点：高于290℃；不溶于酒精等有机溶剂；纯度：99.8-99.9%。经济效益估算：每吨黄芪或黄芪下脚料均可提取NGF 65-85kg或NGS 32-42kg，每公斤NGF的价格为1000-1200元，每公斤NGS的价格为2800-3200元；每吨黄芪和黄芪下脚料的价格分别为14000元和3500元；加工1吨黄芪的费用(包括水电、人工等)约8000元。按提取NGF 65kg、每公斤NGF 1000元价格计，加工1吨黄芪可获利润约4万元，加工1吨黄芪下脚料可获利润约5万元。年加工500-800吨黄芪生产线的设备投资为60-75万元(不包括厂房和锅炉)。