自从大约 30 年前证明，钙在预防人类骨质疏松症中的作用以来，钙的生物利用度一直是众多科学研究的主题。
目前，技术允许生产稳定的无定形钙（ACC）——一种独特形式的钙，让生物利用度分析成为可能。
研究 · 内容
通过将这些制剂溶解在稀磷酸中来评估溶解度。
通过用45标记碳酸钙制剂来评估分数吸收Ca，使用明胶胶囊对大鼠口服给药。
通过评估在血清中测量的每毫升放射剂量的百分比、股骨中的钙吸收和 34 小时内的全身保留来确定吸收分数。
比较ACC、ACC 与壳聚糖 (ACC-C) 和结晶碳酸钙 (CCC) 的溶解度和吸收分数，对其溶解度和生物利用度进行分析。
研究 · 结果
稳定的非放射性 ACC 和 CCC，使用以下方法验证不同制剂的组成：此处考虑的三种碳酸钙制剂的形态差异，如 HR-SEM 所示，呈现在图1。
CCC 由两种结晶形式的混合物组成（图1a），即方解石（菱形）和球霰石（球状）颗粒，尺寸均在 1 至 10 µm 之间。观察到的小球含有较小的纳米级微晶，这种结构连同其 1 到 10 µm 的尺寸，是球霰石的典型特征。
ACC 颗粒（图1b）比方解石和球霰石晶体（图1 ）小 1 到 2 个数量级a)，从而将材料的有效表面积增加多达 1 × 10 6。ACC 的无定形性质由其 40 到 100 纳米的颗粒呈现出不同的形态来描述。
嵌入壳聚糖基质中的 ACC（ACC-C；图1c）也存在具有不同形态的 40 至 100 nm 颗粒。使用 HR-SEM 无法区分 ACC 和 ACC-C，因为 ACC-C 的壳聚糖基质似乎被 ACC 颗粒覆盖，因此在 SEM 图像中不可见。
图1
Scanning electron microscope (SEM) images of three calcium carbonate preparations: (a) Crystalline calcium carbonate (CCC; magnification ×15,000); (b) amorphous calcium carbonate (ACC; magnification ×100,000); (c) amorphous calcium carbonate with chitosan (ACC-C; magnification ×100,000). Bars represent scale.
在获得 CCC 制剂由两个结晶相组成的 HR-SEM 结果后，我们使用了几种光谱方法来确定不同制剂的多晶型组成。
使用的第一种方法是傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱法（图2），其中碳酸盐的振动从一个多晶型物转移到另一个多晶型物允许基于振动的波数确认化合物的多晶型物性质。
CCC 制备光谱揭示了方解石的存在，这反映在大约 870 cm -1处的尖峰和大约 712 cm -1处的峰处。通过在大约 745 cm -1的振动检测到球霰石的存在（图2a ）。
图1所示的 HR-SEM 图像也支持 CCC 制备中方解石和球霰石的存在。
ACC 制剂的光谱特征是在大约 865 cm -1处有一个典型的宽峰（图2b）。ACC-C制剂的光谱在大约864 cm -1处具有宽峰，也表明存在ACC （图2c）。
ACC-C制剂中壳聚糖的存在通过1028、1150和2877 cm -1处的峰来验证，先前仅在壳聚糖的FTIR光谱中确定（由箭头指示）。
没有明显的 CaCl 2或 NaCO 3检测到峰，表明在不同的碳酸钙制剂中没有残留的CaCl 2或NaCO 3 。
图2
Representative FTIR spectra of the three calcium carbonate preparations: (a) Crystalline calcium carbonate (CCC); (b) amorphous calcium carbonate (ACC); (c) amorphous calcium carbonate with chitosan (ACC-C). Note that the intensity is scaled differently for each spectrum; that is, the relative height of each spectrum corresponds to the strongest peak. Arrows point to specific chitosan peaks.
用于验证不同制剂组成的第二种光谱方法是拉曼光谱。
CCC 制剂的拉曼分析（图3a）在 1085.6 cm -1处产生一个尖峰，在 713.3 cm -1处产生一个小峰，代表方解石的存在。
球霰石在该光谱中不可见，因为主要方解石峰的高强度掩盖了通常在 1087 cm -1处显示为双峰的球霰石峰。
ACC 制剂的特征在于在 1079.8 cm -1处有一个宽的拉曼峰，表明存在 ACC（图3b）。
类似地，ACC-C 制剂在 1080.4 cm -1处呈现出宽峰（图3C）。
ACC-C 制剂中存在的壳聚糖在拉曼光谱中没有产生已知的峰，尽管在 ACC-C 的测量过程中获得了独特的背景读数，这可能是由于样品中存在壳聚糖（数据未显示）。
图3
Representative Raman spectroscopy spectra of the three calcium carbonate preparations: (a) Crystalline calcium carbonate (CCC); (b) amorphous calcium carbonate (ACC); (c) amorphous calcium carbonate with chitosan (ACC-C). Note that the intensity is scaled differently for each spectrum; that is, the relative height of each spectrum corresponds to the strongest peak.
在验证碳酸钙制剂的多晶型组成后，我们研究了为该测定制备的合成 ACC 与碳酸钙晶型相比的溶解速率和溶解度。
pH 测量值代表未结合的 H +₃²﹣离子的数量，这与溶解的 CO离子的数量直接相关。CaCO 3溶解成离子Ca 2+和CO₃²﹣越多，获得的pH值越高。
当将碳酸钙制剂溶解在磷酸中时（图4），ACC 和 ACC-C 溶液的最终 pH 值都比方解石溶液观察到的最终 pH 值高 1 个 pH 单位以上，对应于 20 % 增加 ( p < .05)。
ACC 和 ACC-C 溶液的最终 pH 值都比 CCC 制剂的最终 pH 值高 0.5 个 pH 单位以上，反映了 9% 的增加。
表1 Dissolution Parameters
Note: pHMAX represents the final pH that was reached after 240 seconds (pHMAX results are presented as means ± SE). T50% represents the time it took the pH to reach 50% of its maximum value. Different superscript letters represent statistical significances, as determined by ANOVA.
此外（表1），商业方解石需要 49 秒才能达到 50% 的最大 pH 值，而 CCC、ACC-C 和 ACC 分别需要 20、21 和 22 秒才能达到 50% 的最大 pH 值。在所有测试样品中，在分析结束时仍然存在残余沉淀物。
图4
Changes in pH of a 0.01 M phosphoric acid solution following dissolution of calcium carbonate preparations: represents amorphous calcium carbonate with chitosan (ACC-C); represents amorphous calcium carbonate (ACC); represents crystalline calcium carbonate (CCC); and represents commercial calcite. Each line represents the average of five repeats.
图5显示了血清 Ca 浓度的变化，由标准化为给药剂量的放射性读数计算得出。
接受 ACC 的大鼠的Cmax值显著高于（高达 40%）CCC 组（图5和表2）。接受 ACC- C的大鼠的Cmax值也高于接受 CCC 的大鼠（高达 12%），尽管这种差异没有统计学意义（表2）。
表2 Pharmacokinetic Parameters of Calcium in the Serum Following Oral Administration of Radioactive Calcium Carbonate Preparations
Different superscript letters represent statistical significance (p < .05), as determined by ANOVA.
药代动力学分析表明ACC和ACC-C的生物利用度显著高于CCC（AUC值分别高出22.5%和20% ，p < .05)，而达到最大浓度 (Tmax) 所需的时间在各组之间没有差异（表2）。
图5
Serum radioactivity following oral administration of calcium carbonate preparations. Measured radioactivity concentration was divided by the total given radioactivity to calculate the radioactivity percentage of the given dose in the serum. ●= crystalline calcium carbonate (CCC, n = 13); ▲= amorphous calcium carbonate (ACC, n = 13); □ = amorphous calcium carbonate with chitosan (ACC-C, n = 12). Bars indicate SEM in each case. Each line represents the average of n repeats. Pharmacokinetic values of the graph are presented in Table 2.
在验证了不同的制剂性质后，我们进行了生物利用度实验，以单同位素、单次给药的方法测试上述制剂的相对吸收。
30重要的是要注意，尽管我们尽最大努力确保对受试大鼠的压力最小，但我们仍然无法在实验过程中防止一定程度的死亡率。
在生物利用度实验过程中，每组死亡4只（25%）；对死亡大鼠进行的代表性尸检显示胃壁上的食道或膀胱受损，这可能是由给药过程中使用的金属注射器引起的。
图5和图6目前的结果来自在整个实验中幸存下来的大鼠的生物利用度实验，测试了单次口服给药后固有地标记有45 Ca 的前述制剂的吸收分数。
图6A中呈现的股骨中钙含量评估的结果标准化为100mg干骨重
接受 ACC 的大鼠股骨中的钙含量 比接受 CCC 的大鼠高 30% ( p < .05)。接受 ACC-C 的大鼠股骨中的钙含量比接受 CCC 的大鼠高 15%，尽管这些变化没有统计学意义。
图6
Calcium content in the femur and whole-body retention following oral administration of radioactive calcium carbonate preparations. (A) Calcium content in the femur. Calcium content was normalized to 100 mg of dry bone weight. From left to right: Crystalline calcium carbonate (CCC, n = 13), amorphous calcium carbonate (ACC, n = 13), and amorphous calcium carbonate with chitosan (ACC-C, n = 12). (B) Total-body retention of calcium. From left to right: Crystalline calcium carbonate (CCC, n = 13), amorphous calcium carbonate (ACC, n = 13), and amorphous calcium carbonate with chitosan (ACC-C, n = 12). Bars indicate SEM. Different superscript letters represent statistical significance as determined by ANOVA.
图6 B中呈现的保留值表明接受含 CCC 胶囊的大鼠保留了 48.5% ± 1.3% 的接受剂量。
另一方面，接受含 ACC 和 ACC-C 胶囊的大鼠分别保留了 61.4% ± 2.0% 和 60.6% ± 2.1% 的接受剂量。
与 CCC 治疗组的保留率相比，这对应于保留率分别显著增加 26.6% 和 25% ( p < .05)。
表3 Elemental Calcium Weight Percentage in Common Calcium Compound Formulations
Note: Calcium weight percentage was calculated by dividing the calcium molecular weight by the total molecular weight of the salt.
a Amorphous calcium carbonate elemental calcium was evaluated by atomic absorption.
b Exact percentage depends on the complex used.
大鼠测试的所有参数（即血清、股骨和保留值方面）都清楚地证明了：无定形和结晶制剂之间的差异，但此处获得的所有测试制剂的保留结果明显高于大多数以前的类似碳酸钙单剂量实验的报告。
增强的保留结果可能归因于使用的低钙适应饮食和通过明胶胶囊直接给药的使用。
不同多晶型物组合物的效果也可归因于高保留，特别是在包含球霰石和方解石混合物的CCC制备中。
在以前的报告中测试的碳酸钙的多晶型成分从未被提及，因此限制了与我们结果的可比性。
虽然很难在有或没有参考盐的不同钙制剂之间进行比较，但在本研究中获得的保留值与抗坏血酸钙观察到的一样高，并且高于其他钙制剂（如乳酸钙、富马酸钙、柠檬酸钙）所报告的保留值、柠檬酸盐-苹果酸盐、碳酸盐和 TBE。
此外，在考虑膳食钙源的有效性时，还必须考虑这些配方中元素钙含量相对较低。在这方面，ACC 含有较高的元素钙含量，为 33%，如表3所示。
碳酸钙的多态性，在 ACC 的情况下得到了清楚的证明，可以影响大鼠钙的生物利用度。颗粒大小、表面积和溶解度的差异可能会影响肠道对钙离子的吸收，这种情况会增强钙的被动扩散。
ACC 更高钙吸收的另一个可能解释是 ACC 颗粒的纳米性质。这些可能小到足以通过肠上皮细胞作为完整的碳酸钙复合物。先前通过观察大鼠吸收小而完整的复合物（如草酸钙）的能力提出了这一假设。
ACC 给药大鼠股骨中检测到的钙水平升高也可能与血清中检测到的高水平钙有关。
为了进一步增加合成产生的 ACC 与小龙虾产生的 ACC 的相似性，嵌入在几丁质基质中并作为我们的生物学灵感，在合成过程中添加了常用的几丁质脱乙酰衍生物17、18壳聚糖ACC-C。
研究 · 结论
生物利用度评估很大程度上取决于大鼠的年龄、性别和代谢状态，实验模型中的微小变化会显著影响钙的生物利用度。
在未来的研究中应进一步研究无定形碳酸钙的生物利用度及其在包括骨质疏松模型在内的其他模型中的骨骼中的结合。
总之，这项研究揭示了与常用的结晶碳酸钙相比，无定形碳酸钙（ACC）的溶解度和生物利用度更高。
*所有测试参数的显著改进都支持使用 ACC 作为钙的高度可利用的膳食来源。
原文链接：https://asbmr.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jbmr.196
琼公网安备 46010802000728号