稳定的无定形碳酸钙(ACC)是一种天然产生的独特的生物矿物质。从生物源稳定型ACC中提取的蛋白质在体外诱导和稳定合成型ACC。聚磷酸盐分子在体外诱导非晶态碳酸钙的形成。

因此，我们验证了假设生物来源的ACC诱导和稳定是由磷酸化蛋白残基介导的。

从小龙虾胃石中提取的细胞外有机基质可诱导体外稳定的ACC形成。这种有机基质的蛋白质部分被高度磷酸化，并在沉淀过程中并入ACC矿物相。

我们已经确定了主要的磷元素并表明它们具有较高的钙结合能力。基于对有机基质和蛋白质的分析表明，它们具有较高的钙结合能力。

我们进行了单磷酸氨基酸的体外沉淀实验，表明单独的磷丝氨酸或磷苏氨酸可以诱导高度稳定的ACC的形成。结果表明，磷酸蛋白可能在控制ACC的形成和稳定中发挥重要作用，其磷酸氨基酸部分是这一过程中的关键组成部分。

研究 · 简介

无定形碳酸钙(ACC)是一种亚稳相，容易转变为更稳定的碳酸钙晶体相。ACC在多种生物的生物矿化开始时被发现是一种短暂稳定的前体(Addadi等人，2003年)，并被认为在随后的结晶过程中发挥生物控制作用(Gower, 2008年)。

然而，各种生物体产生稳定的ACC不是作为后续结晶相的前体，而是作为“选择”的最终矿物。稳定的ACC通常用于硬化骨骼元素，并作为临时的钙存储(Weiner etal .， 2003)。ACC有几个潜在的生物优势，例如：

(1)各向异性结构，没有首选的生长方向，这使它能塑造成任何想要的形状。
(2)缺乏解理面，这使它比它对应的晶体材料不那么脆(Aizenberg等人，2002)。、
(3)高溶解度结合高表面积，这使它成为改善再吸收的良好临时存储相。
(4)比结晶相(Bentov和Erez)吸收更多微量元素和杂质的能力。

研究 · 结果

CaCO3沉淀与不溶性有机基质和提取肽

Fig. 1. Biogenic ACC from the gastrolith of C. quadricarinatus. (a) Raman spectra ofthe ACC showing the m1 vibration of carbonate as a broad band at 1080 cm1, typicalof ACC, and the m4 vibration of carbonate at 720 cm1. In addition, note thesignificant broad band at 955 cm1 which corresponds to the m1 vibration ofphosphate. (b) SEM micrograph of gastrolith section showing chitinous matrixfibrils interwoven with the ACC nanospheres (bar = 100 nm).

在胃石不溶性基质(ISM-total)存在下的CaCOs沉淀产生稳定的ACC。

得到了拉曼光谱的证实，在1080 cm-1处碳酸盐的vi振动是一个宽频带(图2)，ACC的典型特征(Tlili等人，2002)。合成的ACC为50-250 nm尺寸分布较宽的球体(图3a)。

在ism多肽存在下的沉淀也会导致稳定ACC的形成(图2和3b)。

在两个实验中得到的ACC (ISM-total和ism -多肽)是稳定的，在环境条件下超过四个月后没有结晶迹象(图4a)。

不添加添加剂生产的ACC (Koga等人，1998年)稳定性较差，并在2周内开始转化为vaterite(图4e-f)。在残留的几丁质物质(ism -肽萃取后)存在的情况下沉淀CaCOs，生成方解石(图2)。用蛋白水解酶单独沉淀的对照实验产生方解石(数据未显示)。

Fig. 2. Raman spectra of CaCO3 precipitated in the presence of insoluble matrixfractions. ISM-total and ISM-peptides induced the precipitation of ACC while in thepresence of the residual chitin (ISM-chitin), calcite was precipitated. m1 vibration ofcarbonate is located around 1080 cm1 in ACC, and at 1085 cm1 in calcite. m4vibration is located at 712 cm1 in calcite. The broad band at 955 cm1 (arrow),corresponds to m1 vibration of phosphate.

除了以1080 cm-1为中心的主要拉曼位移外，在955 cm处有一条宽频带(图2箭头)分配给在含ISM的样品中观察到磷酸盐的振动。这种磷酸盐代表有机磷酸盐，被并入合成的ACC中。

合成ACC的SEM显微图

胃石中总磷含量(无机+有机)ICP-AES法测定胃石组分，结果表明胃石中总(有机+无机)P/Ca摩尔比在10 ~ 15 mol%之间。

EDS分析ISM中磷蛋白含量高，被纳入合成ACC，以及已知磷酸化分子对CaCO3结晶的抑制作用(Burton and Walter, 1990;房子,1987;林和辛格，2006;Reddy, 1977)。

我们测试了单磷酸氨基酸对CaCO3结晶的抑制作用。磷酸氨基酸存在下，CaCO3沉淀表明：P-Ser和P-Thr诱导稳定ACC的形成。

Fig. 3. SEM micrographs of synthetic ACC. (a) ACC comprising 50–250 nmnanospheres produced with the addition of ISM-total (bar = 100 nm). (b) ACCcomprising 50–250 nm nanospheres produced with ISM-peptides extracted byproteases (bar = 500 nm).

室温条件下ACC稳定性

合成的ACC在4个月以上的时间内都是稳定的状态，没有显示出结晶过程的迹象(图4b和c)。仅在5个月后，析出物部分结晶为vaterite(图4d)。

形成ACC所需的P-Ser和P-Thr的有效浓度范围为0.1-5 mM (CaCO3浓度为10 mM)。较低的浓度产生ACC、方解石和vaterite的混合物，而较高的浓度则完全抑制所有自发沉淀。

Fig. 4. ACC stability under ambient room conditions. (a) ACC produced with ISMpeptides, after 5 months. (b) ACC produced with P-ser, after 4 months. (c) ACC produced with P-Thr, after 4 months. (d) ACC produced with P-Thr after 5 months,partially transformed to vaterite as indicated by the split bands of m1 and m4carbonate modes (around 1080 and 740 cm1, respectively). (e) Fresh ACC producedwith no additives at high pH. (f) The sample of (e) 2 weeks later: the ACC hastransformed to vaterite as indicated by the split band of m1carbonate mode around1080 cm1.

磷蛋白质的检测

利用PhosDecor在SDS-PAGE上对磷蛋白进行特异性荧光染色，表明ISM中存在多种磷蛋白，在~70- 75kda处有一条显著的磷蛋白双线带(图5a和b)。

对该双线带和ß-酪蛋白的磷酸盐含量进行半定量比较，(2.4%的磷残基)表明70- 75kda的ISM双线带的磷残基大约多5倍(~12%的磷残基)。

钙覆盖实验表明，这些双重蛋白在胃石蛋白中也具有最高的钙结合能力(图5c和d)。

Fig. 5. Phosphoprotein detection and calcium overlay assay of gastrolith proteins.Lane 1, gastrolith soluble proteins; lane 2, insoluble proteins (ISM); lane 3, b-casein(positive control); lane 4, MW ladder. (a) Labeling with the fluorescent probePhosDecor (Sigma) for phosphoproteins. (b) The same gel stained for total proteinwith Coomassie blue. (c) 45Ca overlay. (d) The same gel stained for total protein with Ponceau S dye.

拉曼光谱

相比之下，存在磷酸酪氨酸或非磷酸化丝氨酸的沉淀分别导致方解石和钒铁矿的形成(图6)。

Fig. 6. Raman spectra of CaCO3 in the presence of P-Ser (ACC), P-Thr (ACC), nonphosphorylated serine (vaterite), and phosphotyrosine, (calcite). m1 vibration of carbonate appears as a broad band at 1080 cm1 in ACC, as a split band at 1075,1091 cm1 in vaterite, and as a sharp band at 1085 cm1 in calcite. m4 vibration of carbonate appears at 720 cm1 in ACC, as a split band at 740 and 750 cm1 in vaterite and at 712 cm1 in calcite.

通过拉曼、SEM、XRD和电子衍射分析确定了沉淀的非晶态性质。拉曼光谱(图6)显示了1080 cm-1处较宽的v1碳酸盐振动带。

P-Ser和P-Thr图

SEM显微图(图7)显示，合成的ACC颗粒是20- 300nm多分散纳米球的聚集体。

Fig. 7. (a) SEM micrographs of ACC produced in the presence of P-Ser comprising20-nm to 200-nm nanospheres (bar = 500 nm). (b) ACC induced by P-Thr (1 mM),composed of 50-nm to 300-nm nanospheres (bar = 500 nm).

合成ACC的x射线和电子衍射

SEM显微图(图7)显示，合成的ACC颗粒是20- 300nm多分散纳米球的聚集体。

Fig. 8. X-ray and electron diffraction of synthetic ACC. (a) XRD diffractogram of ACC precipitated in the presence of 2 mM P-Ser and in the presence of 1 mM P-Thr;diffractogram of calcite is shown in gray. (b) TEM image of ACC produced in the presence of P-Thr (bar = 200 nm). (c) Selected area electron diffraction acquired from thisregion, demonstrates the amorphous nature of the precipitate.

综上所述，我们发现从小龙虾胃石中提取的有机基质被高度磷酸化，可以诱导体外稳定的ACC形成。

我们已经鉴定了有机基质的主要磷蛋白，并表明它们具有较高的钙结合能力。进一步证明，单磷酸氨基酸(磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸)可诱导形成高度稳定的ACC。

结果表明，磷蛋白在ACC的稳定中发挥关键作用，其磷酸化残基本身是这一机制的核心组成部分。单磷酸氨基酸所表现出的类似效果强调了单个残基作为ACC稳定的“最低要求”的作用，而不是蛋白质构象。本研究结果可能有助于我们对ACC稳定的生物学机制的基本认识。

"生物稳定无定形碳酸钙（ACC）形成机制对基础营养学的研究具有重要的科学意义。"