前言
2022年03月,欧易/鹿明生物合作客户重庆医科大学附属第二医院消化内科周智航团队在International Journal of Biological Sciences期刊发表的题为 “Enhanced pentose phosphate pathway activity promotes pancreatic ductal adenocarcinoma progression via activating YAP/MMP1 axis under chronic acidosis”的研究成果，通过采用非靶代谢组学和基因表达芯片，发现了适应酸性微环境的胰腺导管腺癌 (PDAC)细胞具有更强的转移和增殖能力。
代谢组学显示适应酸性微环境的 PDAC 细胞中葡萄糖增加、糖酵解减少，而转录组学发现适应酸性微环境细胞中的差异表达基因主要为细胞外基质修饰和 Hippo 信号传导相关基因。MMP1 在在适应酸性微环境细胞中上调最为明显，实验验证了其由 YAP/TAZ 通路介导，而被 AMPK抑制。该研究确认了代谢重编程通过AMPK/ YAP /MMP1轴促进适应酸性微环境的 PDAC 细胞的增殖和转移。
中文标题：适应酸性微环境的胰腺导管腺癌细胞中磷酸戊糖代谢途径增强，通过激活YAP/MMP1 轴促进癌症进展
研究对象：小鼠
发表期刊：Int J Biol Sci
影响因子：6.58
发表时间：2022 年3月
合作单位 : 重庆医科大学第二附属医院消化内科
运用生物技术：非靶向代谢组学(由鹿明生物/欧易生物提供技术支持)、转录组学
研究背景
为适应无限增殖带来的不利生存环境，肿瘤细胞的代谢方式呈现出背景依赖性的灵活性，更倾向于有氧糖酵解。但此种代谢方式产生大量乳酸，导致肿瘤微环境的pH值降低至6.4-7，即酸性微环境。酸性微环境是肿瘤细胞的一种选择压力，存活下来的细胞具有更强的增殖、转移和耐药能力。作为一种公认的促瘤效应，酸性微环境已被用作判断预后和治疗效果的标志物。然而，酸性微环境的机制尚未完全阐明，需要进一步研究。
由于细胞和环境间具有相互作用，所以酸性微环境也可以反过来诱导细胞代谢转变。已有文献报道，急性酸处理（pH 6.8 36 小时）可以上调葡萄糖 6-磷酸脱氢酶的表达来增加胶质瘤干细胞中嘌呤核苷酸从头合成，促进细胞增殖。AMP 活化蛋白激酶 (AMPK) 是一种能量传感器，可监测真核细胞中 AMP:ADP:ATP 的比例。AMPK 作为肿瘤抑制因子肝激酶 B1 (LKB1)的底物，也具有抑瘤效应。AMPK通过磷酸化Hippo-Yap 通路中的衔接蛋白——血管生成素样蛋白1(AMOTL1)，阻断 YAP活性，抑制癌细胞增殖和存活。
在本研究中，作者采用酸性培养基（pH 6.5）连续培养 3 个月制备出适应酸性微环境的 PDAC 细胞。实验表明适应酸性环境的细胞增殖和转移能力增强，基质金属蛋白酶-1 (MMP1) 表达显著上调。此外，代谢组学分析显示，随着细胞内葡萄糖的增加，戊糖磷酸途径 (PPP)有所增强，而糖酵解则明显受到抑制。这种转变进一步增加了 细胞内ATP 水平并抑制 AMPK 信号传导，从而上调了YAP 和 MMP1 的表达，促进PDAC细胞侵袭和转移。作者的研究表明，增加的 PPP 代谢通过 AMPK/YAP/MMP1 轴促进适应酸性微环境的 PDAC 细胞进展。
研究思路
研究结果
在适应酸性微环境的 PDAC 细胞中增强的戊糖磷酸途径抑制了 AMPK 信号通路
通过在 pH 6.5 的酸性培养基中培养三个月获得适应酸性微环境的 PDAC 细胞（PANC-1-AA 和 SW1990-AA），而对照细胞则在 pH 7.4 的 DMEM 中培养（PANC-1-NA 和 SW1990-NA）。应用非靶向代谢组学分析( LC-MS 和 GC-MS)来揭示适应酸性微环境的 PDAC 细胞代谢变化。GC-MS 结果显示 SW1990-AA（图 1A）和 PANC-1-AA 细胞中分别有 99 和 69 种代谢物发生了变化。LC-MS 显示 SW1990-AA（图1B） 和 PANC-1-AA 细胞中分别有 105 和 99 种代谢物发生了变化。联合 LC-MS 和 GC-MS分析结果显示，糖酵解中间代谢产物，例如 6-磷酸果糖 (F6P)含量减少（图1C）。而葡萄糖含量增加（图1D）。
上述结果提示适应酸性微环境的PDAC细胞代谢转向了 PPP。PPP 提供 NADPH 和 5-磷酸核糖 (R5P) 。这两种代谢物对核酸、脂肪酸、甾醇、核苷酸和非必需氨基酸合成至关重要 。作者检测了PPP途径第一步的关键酶G6PDH，发现其在适应酸性微环境的细胞中活性显著增加（图1E），G6PDH下游的NADP+/NADPH比值显著降低（即适应酸性微环境细胞中NADPH 增加）（图1 F）。
此外，PPP的其他下游产物在适应酸性微环境的PDAC细胞中均有不同程度的增加（图1D-H）。此外适应酸性微环境的PDAC 细胞中 AMP 降低，而 ATP 水平较高（图1 I）。这些结果表明，PDAC细胞在增强PPP后可能通过不同的代偿代谢方式来增加细胞内ATP水平。
AMPK 信号是 ATP/AMP 比率的传感器。作者检测到适应酸性微环境细胞中AMPK的磷酸化水平低于对照细胞（图1J)。以上实验结果表明适应酸性微环境的 PDAC 细胞中PPP 的代谢重编程抑制了 AMPK 信号传导。
图1 | 适应酸性微环境的 PDAC 细胞中向戊糖磷酸途径的代谢转变抑制了 AMPK 信号传导
a)GC-MS检测到SW1990-NA和SW1990-AA细胞中代谢物的变化。
b)LC-MS显示SW1990-NA和SW1990-AA细胞中代谢物的变化。
c)PANC-1-AA细胞中代谢物减少和增加的分析。
d)SW1990-AA细胞中代谢物减少和增加的分析。
e)SW1990-NA和SW1990-AA细胞中G6PDH活性的检测。
f)SW1990-NA和SW1990-AA细胞中NADP+/NADPH比率的检测。
g)PANC-1-AA细胞中的通路发生了变化。
h)SW1990-AA细胞中的通路发生了变化。
i)ATP在PANC-1-AA和SW1990-AA细胞中增加。
j)WB检测适应酸性微环境的PDAC细胞及其对照细胞（上图）中AMPK的激活情况。
适应酸性微环境的 PDAC 细胞迁移和侵袭能力增强
作者比较了适应酸性微环境的PDAC细胞和对照细胞的表型差异。通过划痕实验作者发现适应酸性微环境的 PDAC 细胞具有更强的迁移能力（图2 A-B）。而Transwell检测显示，适应酸性微环境的的PDAC细胞侵袭能力也有所提高（图2C-D）。
众所周知，上皮 - 间质转化（EMT）是促进侵袭和转移的重要因素，因此作者检测了EMT标志物的表达。PANC-1-AA 和 SW1990-AA 细胞中 N-钙粘蛋白、波形蛋白、α-SMA、Snail、Zeb1 和 Zeb2 的表达 水平显著增加（图2E-G），但E-钙粘表达水平降低（图2 G）。因此，酸性微环境促进 PDAC迁移和侵袭。
图2 | 适应酸性环境的PDAC细胞迁移和侵袭能力增强
a)伤口愈合试验反映了 PANC-1-AA 细胞中的迁移情况。
b)伤口愈合试验反映了 SW1990-AA 细胞中的迁移情况。
c)Transwell 检测显示PANC-1-AA 细胞具有更强的侵袭能力。右下角的标尺为 200 µm。
d)Transwell 检测显示SW1990-AA 细胞具有更强的侵袭能力。右下角的标尺为 200 µm。
e)qPCR检测在适应酸性微环境的的PDAC及其对照细胞中EMT的标志物
f)WB检测适应酸性微环境的PDAC和对照细胞中Snail和Vimentin的蛋白水平。
g)免疫荧光检测PANC-1-AA/NA和SW1990-AA/NA 细胞（红色）中 E-cadherin 和 β-catenin 的表达。细胞核用 DAPI 染成蓝色。
酸中毒耐受的 PDAC 细胞增殖能力增强
研究表明，与对照细胞相比，适应酸性微环境的结肠癌和宫颈癌细胞具有更快的生长速度。然而，目前尚不清楚慢性酸性微环境是否会影响 PDAC 细胞的增殖。CCK8实验结果表明， PANC-1-AA和SW1990-AA细胞的增殖明显增加（图3A和B）。克隆形成实验也反映了类似的结果（图3C-D)。
此外，作者比较了对照细胞和适应酸性微环境的细胞的细胞周期。S期PANC-1-AA和SW1990-AA的细胞数量明显多于PANC-1-NA和SW1990-NA细胞（图3E和F）。相反，PANC-1-AA 和 SW1990-AA 细胞的凋亡少于 PANC-1-NA 和 SW1990-NA 细胞（图3 G - H)。因此，适应酸性微环境的PDAC细胞比对照细胞增殖能力更强，且凋亡减少。
图3 | 适应酸性环境的PDAC 细胞增殖增加
a)CCK8检测PANC-1-AA/NA细胞中的细胞增殖。
b)CCK8检测SW1990-AA/NA细胞中的细胞增殖。
c)酸性环境对PANC-1细胞克隆形成的影响。
d)酸性环境对SW1990细胞克隆形成的影响。
e)流式细胞术检测PANC-1-AA细胞和对照细胞中细胞周期的变化。
f)流式细胞术检测SW1990-AA细胞和对照细胞中细胞周期变化。
g)流式检测适应酸性微环境的PDAC细胞和对照细胞中细胞凋亡的情况。
MMP1 在适应酸性微环境的 PDAC 细胞中显著上调
作者通过微阵列芯片技术分析了PANC-1-NA和PANC-1-AA细胞的差异表达基因，并发现PANC-1-AA细胞中MMP1、ASIC2和NANOG的表达显著上调，而LONRF2、BMP4和COL5A1的表达显著降低。其中，变化最明显的基因是MMP1（图4A）。葡萄糖转运蛋白 SLC2A12 在 PANC-1-AA 细胞中也表达增加，这意味着葡萄糖从糖酵解代谢转向到PPP，后者为核酸、脂肪酸、甾醇、核苷酸和非必需氨基酸合成提供原料。GO分析显示PANC-1-NA和PANC-1-AA细胞之间的主要区别在于细胞粘附和细胞外基质相关基因（图4B）。qPCR 和 WB 分析显示 MMP1 的 mRNA 和蛋白质水平在 PANC-1-AA 细胞和SW1990-AA 细胞中均增加（图4 C 和 D）。
MMP1可以降解多种胶原蛋白和其他细胞外基质。MMP1 表达水平在各种恶性肿瘤中增加，并与患者预后呈负相关。TCGA数据库显示，大多数癌组织中MMP1的表达明显高于癌旁组织（图4E）。然而，MMP1与胰腺癌的关系却鲜有研究，尤其是与胰腺癌的酸性微环境之间的关系还尚不清楚。作者通过免疫组织化学检测了 61 名 PDAC 患者组织中 MMP1 的表达（图4 F），发现 MMP1 的表达越高，病人预后越差（图4G），MMP1的表达水平与肿瘤大小呈正相关（图4H）。此外，生物信息学分析也说明MMP1的表达水平与肿瘤分期（图4 I）和病人不良预后（图4 J）相关。
临床样本的病理学特征显示，MMP1 的高表达与酸性标志物碳酸酐酶 9 (CA9) 以及酸敏感离子通道 ASIC1、ASIC2 相关（表1）。这些结果表明，适应酸性环境的PDAC 细胞中MMP1的高表达与其侵袭能力相关。
图4 | 适应酸性环境的PDAC 细胞中 MMP1 表达水平升高
a)高通量微阵列芯片火山图分析基因表达变化的情况。
b)高通量微阵列芯片GO分析结果。
c)qPCR检测适应酸性微环境的PDAC 细胞和对照细胞中MMP1的转录水平。
d)WB检测适应酸性微环境的PDAC 细胞和对照细胞中MMP1的蛋白水平。
e)通过TCGA数据库分析多种肿瘤中MMP1 mRNA的表达。BLCA：膀胱尿路上皮癌；BRCA：浸润性乳腺癌；CESC：宫颈鳞状细胞癌；CHOL：胆管癌；COAD：结肠腺癌；ESCA：食管癌；GBM：多形性胶质母细胞瘤；HNSC：头颈部鳞状细胞癌；KICH：肾嫌色细胞癌；KIRC：肾透明细胞癌；KIRP：肾乳头状细胞癌；LIHC：肝细胞癌；LUAD：肺腺癌；LUSC：肺鳞状细胞癌；PAAD：胰腺癌；PRAD：前列腺腺癌；PCPG：嗜铬细胞瘤和副神经节瘤；READ：直肠腺癌；SARC：肉瘤；SKCM：皮肤黑色素瘤；THCA：甲状腺癌；THYM：胸腺瘤；STAD：胃腺癌；UCEC：子宫内膜癌。
f)免疫组化检测PDAC癌组织中MMP1的表达情况(n=61例患者)。标尺为 200 μm（上图）和 100 μm（下图）。
g)MMP1的表达水平与PDAC 患者预后的关系(n=61 患者)。
h)MMP1表达水平与胰腺癌大小的关系。
i)通过TCGA数据库分析MMP1的表达情况与PDAC分期的关系。
j)通过Kaplan-Meier数据库分析MMP1表达水平与患者预后的关系。
干扰MMP1的表达可抑制适应酸性微环境的PDAC细胞侵袭和转移
数据库分析显示，MMP1的表达与CA9、MCT1（单羧酸转运蛋白1）和MCT4（单羧酸转运蛋白4）等酸性标志物呈正相关，提示MMP1与酸性微环境关系密切 。作者干扰MMP1的表达后（图5A-B)，发现适应酸性微环境的PDAC细胞侵袭能力明显降低（图5 C-D）。通过尾静脉注射PDAC细胞建立小鼠体内转移模型，结果显示，与对照细胞相比，适应酸性微环境的PDAC 细胞转移能力增强，而敲低 MMP1后，PDAC-AA 细胞的体内转移受到了抑制（图5 E - F）。因此，MMP1在适应酸性微环境的 PDAC 细胞侵袭和转移过程中发挥中重要作用。
图5 | 敲除 MMP1抑制适应酸性微环境的PDAC 细胞转移
a)qPCR和WB检测干扰慢病毒对PANC-1中MMP1表达的抑制作用。mRNA 水平（左），蛋白质水平（右）。
b)qPCR和WB检测干扰慢病毒对SW1990中MMP1表达的抑制作用。mRNA 水平（左），蛋白质水平（右）。
c)Transwell检测敲低MMP1对PANC-1侵袭的影响。右下角的标尺为 200 µm。
d)Transwell检测敲低MMP1对SW1990侵袭的影响。右下角的标尺为200 µm。
e）-f） H&E 染色检测体内转移中肺转移灶的情况。标尺：100 倍放大倍率，200 µm；400 倍放大倍率，50 µm。
适应酸性微环境的 PDAC 细胞中活化的YAP/TAZ 信号增加了MMP1的表达
为了探索酸性微环境中MMP1的调控机制，作者回顾了芯片结果，发现Hippo信号通路发生了显著变化（图6A）。作者检测了 Hippo 通路关键分子 YAP 和 TAZ 的表达和活化情况。结果显示，PANC-1-AA和SW1990-AA细胞中YAP和TAZ的表达水平显著高于PANC-1-NA和SW1990-NA细胞（图6B）。已知，当 YAP/TAZ 被磷酸化时，它们的活性则受到抑制。非磷酸化的 YAP/TAZ 作为共转录因子进入细胞核，与 TEA 结构域转录因子 (TEADs) 结合，促进癌基因转录。因此，作者选择 YAP/TAZ 抑制剂 ML-7 来阻断它们的活性。用ML-7处理后，PANC-1-AA和SW1990-AA细胞中YAP和TAZ的活化水平以及MMP1和Snail的表达均显著降低（图6C ）。划痕和Transwell 分析显示ML-7降低了PANC-1-AA 和 SW1990-AA 细胞的迁移与侵袭能力（图6 D-E）。此外，与NA细胞相比，YAP/TAZ抑制剂还显著抑制适应酸性微环境细胞的增殖（图6F）。
通过数据库预测，作者发现在 MMP1 的启动子区域有一个YAP/TAZ 效应分子TEAD4 的结合位点（图6G）。作者用AMPK 激活剂 MK8722 处理 PDAC 细胞，可以显著下调 YAP 和 MMP1的表达（图6 H），且有效减少YAP的核转位（图6 I）。以上结果表明AMPK可以通过抑制Hippo下游信号YAP/TAZ减少MMP1的表达。
图6 | Hippo通路的失活介导了酸中毒耐受细胞中MMP1过表达
a)差异表达基因的KEGG分析表明，Hippo通路适应酸性微环境的PDAC细胞中发生了显著变化。
b)WB检测适应酸性微环境的PDAC细胞和对照细胞中YAP和TAZ的蛋白表达水平。
c)在PANC-1和SW1990中用10 µM YAP/TAZ抑制剂ML-7处理24小时后，WB 检测 YAP、MMP1 和 Snail 的蛋白表达水平。
d)在PANC-1和SW1990中用 YAP/TAZ 抑制剂 ML-7处理24小时后，transwell检测细胞侵袭的变化。
e)在PANC-1和SW1990中用 YAP/TAZ 抑制剂 ML-7处理24小时后，划痕实验检测细胞迁移的变化。
f)用ML-7处理后，CCK8检测细胞的增殖情况。
g)TEADs和MMP1启动子之间的结合位点预测。
h)在PANC-1和SW1990细胞中用1 µM AMPK抑制剂MK8722处理24小时后，WB检测 p-AMPK、AMPK、YAP、MMP1 蛋白表达水平。
i)免疫荧光检测YAP的表达和核转位情况。标尺为75µm。
酸性微环境促进PDAC进展的机制假说
在适应酸性微环境的PDAC 细胞中，葡萄糖通过 GLUT12 转运蛋白进入细胞，增加葡萄糖 6 磷酸 (G6P) 和磷酸戊糖途径 (PPP)，从而影响氨基酸或磷脂酰胆碱 (PC)、鞘磷脂 (PS) 等代谢，升高ATP水平并抑制AMPK，从而通过AMOTL1激活YAP/TAZ。YAP/TAZ 易位进入细胞核并与 TEAD4 结合，促进 MMP1 转录，增加 MMP1表达水平，导致 PDAC 细胞转移和增殖。
图7 | AFADESI-MSI成像技术研究Control组和DN组肾脏中L-卡尼汀及其衍生物的变化
研究结论
研究表明，由于高代谢活性和灌注不足，肿瘤细胞容易形成酸性微环境。适应酸性微环境的肿瘤细胞通常表现出更强的侵袭性，这是通过酸诱导的细胞运动、细胞外基质降解、免疫反应降低和信号通路的改变来实现的，但其具体调控机制尚未完全阐明。该研究表明，在适应酸性微环境的 PDAC 细胞中，糖酵解被显著抑制，而细胞内ATP、葡萄糖和其他代谢物增加。这种代谢重编程导致 AMPK活性降低。有趣的是，葡萄糖转运蛋白 SLC2A12 (GLUT12)在适应酸性微环境的PDAC 细胞中也表达增多，这一证据表明，适应酸性微环境的细胞能吸收更多的葡萄糖来促进它们发展。
尽管在适应酸性微环境的 PDAC 细胞中葡萄糖含量升高，但由于糖酵解的多种中间产物减少，说明糖酵解途径减弱。PPP是葡萄糖分解代谢的另一种方式。PPP 能够运用G6P 生成 F6P 和甘油醛 3-磷酸 (G3P)。PPP 提供 NADPH 和 R5P 而不是 ATP。这两种代谢物对细胞存活和增殖至关重要，已有研究表明PPP可增强乳腺癌细胞的化学抗性。根据实验结果，作者提出适酸性PDAC细胞中葡萄糖转向PPP代谢途径。
AMPK 被认为是抑制癌症的代谢传感器，可以启动一系列下游途径，包括 Hippo。作者发现在适应酸性微环境的PDAC 细胞中AMPK受到抑制，而Hippo 通路效应分子 YAP 和 TAZ却被显著激活，进而促进MMP1的表达。该研究揭示了酸性微环境中MMP1的调控机制，丰富了酸性微环境对MMP家族调控的研究。
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通过建立适应酸性微环境的PDAC细胞模型，作者使用非靶代谢组学发现随着细胞内葡萄糖的增加，糖酵解减少，戊糖磷酸途径 (PPP) 代谢发生转变；并同时联合芯片转录组技术，发现这转变过程中关键基因MMP1和Hippo 信号传导基因表达的变化情况。这项研究运用多组学技术联合揭示了酸适应过程中关键的代谢和转录特征。
这项研究首次表明，转向PPP的代谢重编程可以通过AMPK/YAP/MMP1轴促进适应酸性微环境的PDAC细胞的转移和增殖，研究丰富了酸性环境促进肿瘤进展的机制。
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