单细胞测序助力解析miR-6077促进肺腺癌顺铂/培美曲塞耐药机制

前言

近日，欧易生物合作客户复旦大学附属中山医院王群教授团队在Molecular Therapy: Nucleic Acids（IF:8.886）发表miR-6077通过CDKN1A/细胞周期阻滞和KEAP1/铁死亡通路促进肺腺癌顺铂/培美曲塞耐药相关研究结果，毕国澍、梁嘉琪、赵梦男为文章共同第一作者，欧易生物提供了该项目的单细胞转录组测序工作，下面我们一起学习这篇文章的具体内容。

材料： 4例术前CDDP/PEM治疗病人LUAD组织，4例未治疗病人LUAD组织

期刊： Molecular Therapy: Nucleic Acids

发表时间：2022年3月28日

运用欧易/鹿明技术：欧易生物10× Genomics单细胞转录组测序

研究背景

肺腺癌 (LUAD) 是全球最常见的恶性肿瘤之一。顺铂（CDDP）+培美曲塞（PEM）联合化疗仍然是主要的治疗方案，然而药物抗性极大地限制了其治疗潜力。本篇文章中作者通过CRISPR-Cas9筛选，将miR-6077确定为LUAD中CDDP/PEM抗性的关键驱动因素，在细胞系和患者来源的异位移植模型中，通过功能实验证实， miR-6077的异位过表达使LUAD细胞对CDDP/PEM脱敏。通过对接受CDDP/PEM治疗的患者样本进行RNA测序和单细胞测序，发现CDDP/PEM诱导的CDKN1A和KEAP1上调，进而分别激活细胞周期停滞和铁死亡，从而导致细胞死亡。

通过miRNA pull-down，确定并验证了miR-6077靶向CDKN1A和 KEAP1。miR-6077可以通过CDKN1A-CDK1介导的细胞周期停滞和 KEAP1-NRF2-SLC7A11/NQO1介导的铁死亡，保护LUAD细胞免受 CDDP/PEM 诱导的细胞死亡，从而在体外和体内导致LUAD 细胞的耐药。并且发现GMDS-AS1 和 LINC01128 通过吸附 miR-6077 使LUAD细胞对CDDP/PEM敏感。总的来说，这些结果表明miR-6077 在LUAD对CDDP/PEM敏感性中的关键作用，从而为临床实践中克服耐药性提供了一种新的治疗策略。

研究内容解析

miR-6077的发现和功能验证

（1）为了深入了解可能调节LUAD细胞对CDDP加PEM联合化疗敏感性的机制，作者首先进行了基因组规模的CRISPR-Cas9功能筛选试验，sgRNAs转入到A549 细胞中用PBS或者CDDP/PEM处理7 或14天后进行转录组测序测量不同基因或 miRNA被敲除的细胞群的相对丰度，评估不同组别中sgRNA的表达。共筛选出11个能够导致A549细胞对CDDP/PEM显著敏感的miRNA，其中5个候选 miRNA具有单个剪接体并且以前没有被报道过。其中miR-6077的过表达仅在CDDP/PEM存在的情况下导致细胞活力显著增加，因此表明miR-6077可能作为LUAD对CDDP /PEM化疗抗性的关键调节因子。

（2）为了进一步确定miR-6077的临床相关性，作者研究了其在肿瘤样本中的表达，样本为CDDP/PEM 抗性组 (n = 10) 和敏感组 (n = 10)。结果发现CDDP/PEM 耐药组的肿瘤中miR-6077水平显著高于敏感组织，而在淋巴细胞或其他非肿瘤细胞中，miR-6077的水平远低于肿瘤细胞中的水平，在测量 miR-6077在评估肿瘤对CDDP/PEM治疗的反应中的预测值时，发现 miR-6077 水平的受试者ROC曲线下面积为 0.850，这些数据表明miR-6077与LUAD患者的 CDDP/PEM耐药相关。

（3）为了进一步深入了解miR-6077在调节 LUAD耐药性中的作用机制，作者利用pull-down实验和RNA-seq 来寻找A549 细胞系中与miR-6077结合的候选基因。基于来自结构和功能分析的证据，作者筛选了 CDKN1A和KEAP1以进行进一步的实验验证。miR-6077的过表达显著抑制LUAD中CDKN1A和KEAP1在mRNA和蛋白质水平上的表达。表明由CDDP/PEM处理引起的CDKN1A和KEAP1表达增强被miR-6077部分消除。进一步使用双荧光素酶报告基因检测证明CDKN1A和KEAP1是miR-6077的直接下游靶标。

图1 | 全基因组CRISPR-Cas9筛选发现miR-6077 是LUAD 耐药性的重要因素

miR-6077逆转CDDP/PEM诱导的细胞周期停滞和铁死亡

后续作者进一步研究了miR-6077通过靶向抑制CDKN1A和KEAP1导致CDDP/PEM抗性的下游细胞信号通路。针对CDDP/PEM处理或未处理的A549细胞的转录组测序差异基因富集分析显示，在 CDDP/PEM处理后，一系列参与细胞周期和铁死亡相关生物学途径的基因，包括细胞周期G2/M转变、脂肪酸氧化的调节和氧化应激的反应均显著失调。为了消除来自位于肿瘤微环境中的其他非癌细胞的肿瘤内异质性，作者使用单细胞转录组测序来精确描述 CDDP/PEM治疗诱导的转录改变。经过质控后治疗组共38599个细胞，未治疗组共32372个细胞用于下游分析。降维聚类和marker基因分析识别肿瘤细胞（EPCAM 和SOX4）后进行两组间GSEA分析，同样发现细胞周期和铁死亡相关通路，这些结果表明，这两种途径在LUAD细胞中被CDDP/PEM处理激活。

后续作者一方面对miR-6077进行异位表达，发现其能够抵消CDDP/PEM处理后肿瘤细胞G2/M 停滞的异常细胞周期进展，这些结果暗示miR-6077保护CDDP/PEM处理的LUAD细胞免受细胞周期停滞，导致耐药性和产生和细胞存活；另一方面针对铁死亡途径，作者首先验证CDDP/PEM对肿瘤细胞增殖和活力的抑制作用是由铁死亡引起，后续同样通过miR-6077的外源过表达，表明miR-6077可以缓和肿瘤细胞的铁死亡效应。总之，这些结果表明，除了经典的细胞死亡形式，如细胞凋亡和坏死外，CDDP/PEM可以通过铁死亡诱导细胞毒性，而miR-6077部分消除了这种效应并使 LUAD 细胞对CDDP/PEM治疗脱敏。

图2 | miR-6077保护LUAD细胞免受CDDP/PEM处理诱导的细胞周期停滞和铁死亡

miR-6077靶向CDKN1A抵消G2/M期阻滞并赋予肿瘤细胞CDDP/PEM 抗性

为了确定CDKN1A在miR-6077诱导的G2/M阻滞衰减和CDDP/PEM抗性中的介导作用，作者在LUAD细胞系中过表达或敲低CDKN1A，细胞毒性和克隆形成实验表明，CDKN1A过表达抵消了miR-6077诱导的CDDP/PEM脱敏作用。具体机制方面，miR-6077对CDKN1A 的抑制作用导致CDK1及其活性形式p-CDK1-Thr161的上调，而这种作用通过CDKN1A恢复得以抵消，此外，当与PEM联合使用时，CDKN1A的抵消作用也使细胞对卡铂和奥沙利铂敏感。总之，这些结果表明miR-6077以CDKN1A依赖的方式以及 CDKN1A的下游细胞周期调节使LUAD细胞对CDDP/PEM具有耐药性。

miR-6077靶向KEAP1，从而降低铁死亡并赋予肿瘤细胞CDDP/PEM抗性

为了验证miR-6077靶向KEAP1的效应，作者在LUAD 细胞系中回复表达KEAP1，结果发现KEAP1上调可以消除miR-6077 的影响，导致在CDDP/PEM存在下抑制细胞活力和克隆形成能力，中和miR-6077对CDDP/PEM引起的铁死亡的保护作用。此外，WB显示miR-6077 诱导转录因子NRF2及其下游靶基因SLC7A11和NQO1的表达，这两者都有助于抗铁死亡，而这种效应被回复KEAP1而消除，在LUAD细胞中过表达KEAP1也证实了上述结果。总的来说，这些研究结果表明，miR-6077通过抑制KEAP1赋予LUAD细胞CDDP/PEM抗性，从而保护细胞免受铁死亡。

图3 | 抑制miR-6077导致LUAD细胞对CDDP/PEM的化学敏感性

GMDS-AS1和LINC01128通过充当miR-6077的海绵使LUAD对CDDP/PEM敏感

进一步探索miR-6077的上游调控机制，作者通过结合miRNA pull-down实验结果和在线工具预测了预测了5个可能与之结合的lncRNAs。通过细胞毒性试验和qPCR初步评估候选分子在化学敏感性调节中的潜在功能，选择GMDS-AS1和LINC01128进行后续实验。一方面实验验证双萤光素酶实验验证其与miR-6077结合，另一方面lncRNA pull-down和WB实验表明lncRNA和Ago2参与miRNA介导的mRNA抑制，RIP实验同样证实了以上结果。这些结果表明GMDS-AS1和LINC01128与下游CDKN1A/KEAP1竞争含有 miR-6077的RISC，从而防止其mRNA降解。后续通过细胞内的GMDS-AS1和LINC01128的过表达发现其可以抵消miR-6077的作用，上调CDKN1A和KEAP1，减少G2/M转换和铁死亡信号分子表达。这些结果表明 GMDS-AS1 和 LINC01128 通过靶向 miR-6077 作为调节 CDKN1A 和 KEAP1 表达的竞争性内源性 RNA 发挥作用，从而在 LUAD 细胞用 CDDP/PEM 处理时促进细胞周期停滞和铁死亡。

miR-6077敲降和体外实验证实miR-6077促进 LUAD细胞对CDDP/PEM的耐药性

首先作者将miROFF-6077抑制剂转染到H1299-CDDP/PEM 细胞进行miR-6077敲降，发现CDKN1A 和 KEAP1 的表达上调，单细胞数据也表明与未接受新辅助化疗的细胞相比，来自CDDP/PEM治疗组的细胞群的特征是CDKN1A和KEAP1的表达更高。另外，miR-6077 敲低可以降低 H1299-CDDP/PEM 的化学抗性，并加重化疗诱导的细胞周期停滞和铁死亡，这些结果与上述结果一致，证明 miR-6077 通过直接与CDKN1A 和 KEAP1结合来调节细胞周期进程和铁死亡，从而有助于 LUAD 对 CDDP/PEM 的抗性。

其次在小鼠体内细胞系成瘤和PDX模型均证明在miR-6077注射后呈现一定的耐药性，同样证实miR-6077在LUAD细胞对CDDP/PEM的耐药性中的重要作用。

研究结论

1. 表明 miR-6077 驱动肿瘤细胞对CDDP/PEM 的耐药性，并且是接受联合化疗的LUAD患者的预后生物标志物；

2. 阐明CDKN1A 和KEAP1的特异性靶向是 miR-6077减轻肿瘤细胞在CDDP/PEM 处理后 G2/M期停滞和铁死亡的分子机制；

3. GMDS-AS1和LINC01128 可以充当miRNA海绵发挥作用，从而在调节 LUAD耐药性方面产生与miR-6077相反的作用。

这些发现对我们理解LUAD的耐药性具有重要意义，针对上述分子可能为对CDDP/PEM治疗不敏感的LUAD提供新的治疗策略。

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