探秘！会发光的酵母双杂交？

酵母双杂交技术，自创建以来被广泛应用于蛋白互作研究领域，在生命科学的基础探秘研究中起着重要作用。然而该技术设计初衷，仅是Stanley先生为了完成申请学校经费的目的。

该技术设计巧妙，它的许多优点在设计之初并未显现，反而在这么多年的高频使用和进一步开发利用过程中越发明显。小欧简单列举一下（引用自Marc Vidal & Stanley Fields 的“The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years”）：

（1）尽管酵母杂交技术揭示了蛋白质结合位点的详细信息，但操作简单。只需2个质粒+1个菌株即可完成，且有不同体系方便选择。
（2）该技术利用最佳的DNA结合位点，有效的激活结构域和友好的报告基因系统，可以放大弱互作的信号。
（3）该技术可用于各种物种的蛋白互作检测，具有物种普适性，尤其是人类蛋白。
（4）衍生技术具有更广泛的应用，可扩展到检测蛋白质与DNA、蛋白质与RNA、蛋白质与小分子以及其他组合之间的相互作用，甚至可实现将生理相互作用与表型数据直接关联。

当然，做过酵母杂交实验的小伙伴应该都了解，互作结果的判断，往往要等酵母生长好几天才能看出来（当然，小欧认为这在伟大的科研事业过程中算不上啥），互作强弱也是主观判断性较强，存在假阳性。基于此，有研（hao）究（shi）者为进一步优化酵母杂交实验体系，实现更客观、快速的判断蛋白互作强弱，降低假阳性及假阴性，对酵母杂交系统进行了优化改造，可实现不用涂板和固体培养就能客观、定量的判断蛋白互作程度。快来和小欧一起看看靠谱不靠谱吧~

首先，文章标题中的NanoLuc了解一下：NanoLuc是一种来源于深海虾的小型分泌荧光素酶，其亮度是常用的萤火虫和瑞尼拉荧光素酶的100倍；它的高稳定性、低背景、宽阈值使其成为Y2H定量蛋白互作强弱的理想候选报告基因。

该研究中，用NanoLuc荧光素酶取代了BK100中的ADE2报告基因，得到了BK100Nano。当蛋白互作，激活报告基因表达时，即能得到blingbling的酵母菌，改造原理示意图如下：

图1| Generation and characterization of BK100Nano. Integration strategy used to replace ADE2 in the GAL2-ADE2 locus of BK100 with NanoLuc luciferase (Nluc). Regions of homology are illustrated by shaded rectangles and dotted lines.

那么问题来了，如何来检测发光信号呢？菌液要培养多久才能用于检测？检测酵母菌液的哪一部分呢？培养液？上清？菌体裂解液？发光值如何分析判断？

研究者进行了对比检测实验，结果发现：

①虽然酶解酶处理产生了最高的发光强度，但使用未处理的细胞培养物可以用更少的步骤获得相同的信号/背景值（如图2-A）（怎么选？相信你心里已经有了答案~）；

②发光强度与菌液OD值存在线性关系，在测发光值前需要先测菌的OD值，以用于数据归一；

③菌液样品的培养时间及用量标准：综合分析发现，将过夜菌液按照1:10稀释后，再孵育3小时，然后测量发光活性条件最优，效率最高；

④通过分析互作组与阴性对照组间发光值差异程度，可一定程度降低假阳性和假阴性。

图2 | NanoLuc signal is detectable with whole cell cultures. (A) Comparison of luminescence intensity from untreated cells plus culture medium (Culture), culture supernatant (Sup), cells lysed with glass beads (Beads) and cells or supernatant following zymolyase treatment (Zymo, Z Sup). (B) Correlation between cell density and luminescence intensity.

当然，小欧最关心的还是更换报告基因后，结果判断的准确性。关于这方面，研究者设计了对比实验进行了可靠性验证（你猜结果准确不准确呢），顺便给出了一个高通量检测蛋白互作方法（即使用96孔板）。

具体如何进行的呢？简单概括一下就是，同时使用-His报告基因体系和NanoLucLuC体系，以同一个诱饵与74个互作蛋白进行一对一验证，然后对两种方法获得的74对一对一验证结果进行比较分析，结果发现两种结果检测重叠性为91%。

图3 | Comparison of positive interactions identified in NanoLuc assay and yeast two-hybrid growth assay. (A) Luminescence intensities of 74 human gene fragments identified for filovirus VP40 partners. Each human gene was tested against mVP40 and GFP as the negative control. B) Diploid yeast cultures were plated in parallel on S.D. -TL and -TLUH + 1mM 3AT and incubated for 3 and 6 days, respectively.

BTW，该研究中使用Synergy 4Multi-Detection Microplate Reader测定96孔板中菌液的OD值和发光值，下图是小欧网上找到的Reader本机。