16S+代谢组学探究不同直链淀粉/支链淀粉比例改善山羊的盲肠环境

前言

2021年11月，在Frontiers in nutrition期刊发表的题为 “Dietary Amylose/Amylopectin Ratio Modulates Cecal Microbiota and Metabolites in Weaned Goats ”的研究成果，通过16s RNA和LC-MS/MS非靶代谢组学的研究方法，研究不同比例直链淀粉/支链淀粉喂养的山羊盲肠微生物变化特征，描绘了山羊盲肠的代谢图谱。

中文标题：膳食直链淀粉/支链淀粉比例调节断奶山羊的盲肠微生物群和代谢物

研究对象：山羊盲肠

发表期刊：Frontiers in nutrition

影响因子：6.576

发表时间：2021年11月23日

运用生物技术：16s RNA和LC-MS/MS非靶代谢组学

研究背景

反刍动物具有更好的降解大量淀粉的潜力，有几个因素决定了淀粉在瘤胃中的消化速率和程度，如结晶度，直链淀粉/支链淀粉的比例等。直链淀粉和支链淀粉是淀粉的主要成分，可以决定淀粉的营养和生化性质。喂养高瘤胃可降解淀粉会增加奶山羊后肠炎症的风险，白细胞介素-1β和分泌性免疫球蛋白A（SIgA）表达的增加，并积累短链脂肪酸（SCFAs）和造成微生物功能紊乱。为反刍动物开发有效的饲养方法需要在现代喂养系统中保持最佳的瘤胃和后肠发酵。

为了解决这个问题，在饮食中加入最佳比例的直链淀粉/支链淀粉可能是有效的解决方法。为了优化饮食配方，研究者们需要了解不同比例的直链淀粉/支链淀粉引起的后肠发酵曲线和代谢物上的变化。因此，本文作者使用不同比例的直链淀粉/支链淀粉的玉米来喂养黑山羊，全面评估不同比例对后肠微生物组和代谢组的影响。

研究思路

研究结果

 盲肠消化道中的微生物 SCFAs（短链脂肪酸）和粘膜中的细胞因子浓度

与T1组相比，T2组的乙酸盐和丙酸盐增加，T3中的丙酸盐增加。而T2中的戊酸盐浓度高于T1组和T3组（图 1）。但是，当直链淀粉/支链淀粉比值增加时，丁酸盐、异丁酸盐和异戊酸盐的浓度不受影响。

图1 |直链淀粉/支链淀粉比值对盲肠SCFAs浓度（μmol/g）的影响

与T1和T3组相比，T2组的IL-6和TNF-α减少，而IL-10增加（图2）。IL-2和IFN-β浓度在3组间的差异不明显。

图2 | 直链淀粉/支链淀粉比值对盲肠细胞因子浓度（pg/mg蛋白）的影响

粘膜相关微生物组

对盲肠粘膜样本进行检测。使用Chao1和Shannon指数评估粘膜16sRNA测序相关微生物谱的α多样性，3个组细菌群落在丰富度和多样性上没有显著差异（图3 A）。PCoA结果显示，T2组和T3组都是从T1组中形成的单独聚类，而且T2组和T3组聚集在一起（图4 A）。图5A展示的是在门水平上，粘膜相关微生物的相对丰度。鉴定出 10 个优势细菌门，平均相对丰度≥1%，其中厚壁菌门、拟杆菌门和螺旋体门是最主要的门，平均共占群落的85%以上。

三组间比较发现，T2组和T3组螺旋体菌的相对丰度显著高于T1组，T2组的变形杆菌相对丰度低于T1组，T3组疣微菌门的相对丰度低于T1和T2组（图5 C-E）。LDA与LEfSe分析发现，与另外两组相比，Akkermansia在T2中富集；Lachnospiraceae_NK4A136_group和马氏菌等在T3组中富集；微单孢子虫科和Clostridium_sensu_stricto等在T1组中富集（图6 A）。

图3 | 直链淀粉/支链淀粉比值对盲肠粘膜和消化道α多样性指数的影响

图4 |直链淀粉/支链淀粉比值对盲肠粘膜β多样性影响

图5 | 盲肠粘膜和消化道中门水平细菌的相对丰度

图6 | 线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）分析

消化相关微生物组

对盲肠消化样品进行检测。类似的，三组间Chao1、Shannon指数无显著差异（图3 B）。PCoA显示T2组和T3组聚集在一起（图4 B）。图5B显示了消化相关细菌门的前10个门的丰度，其中厚壁菌门、拟杆菌门和疣微菌门是优势门，共占种群的95%以上。三组间比较发现，T2组和T3组的厚壁菌门的相对丰度高于T1组。相反的，T2组和T3组的疣微菌门和软壁菌门的相对丰度少于T1组（图5 F-H）。LDA与LEfSe分析发现，与另外两组相比，Lachnospiraceae_ND3007_group等在T1组中富集；厚壁菌门的乳酸杆菌和粪杆菌在T2组中富集；铁线菌门的Candidatus_Saccharimonas在T3组中富集（图6 B）。

盲肠微生物组与SCFAs的相关性分析

将SCFAs和前10个细菌属用于Pearson的相关性分析。结果发现黏膜相关的Akkermansia的相对丰度与戊酸盐、异戊酸盐、丙酸盐和异丁酸盐呈正相关关系。消化相关Ruminococcaceae_UCG-005的相对丰度与丙酸盐、乙酸异丁酸酯、丁酸盐和戊酸呈正相关关系，同时，消化相关的Christensenellaceae_R 7_group的相对丰度与乙酸盐和丁酸盐呈正相关关系。（图7）

图7 | SCFAs与粘膜（A）和消化（B）中前10名主要菌的相关性网络分析

盲肠组织的非靶向代谢组谱

对样本进行LC-MS非靶向代谢组学分析，偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型表明，三个组能明显区分开（图8 A）。KEGG分析表明，34个KEGG途径受到直链淀粉/支链淀粉比例的影响。三个组两两（T1与T2，T1与T3以及T2与T3）比较分析，分别鉴定出了30，26和22个差异代谢物（图8 B-D）。由DAM构建的HCA热图揭示了不同直链淀粉/支链淀粉比例组代谢物谱的差异（图9 B-D）。

图8 | 偏最小二乘判别分析 （PLS-DA）和火山图

图9 | 差异代谢物KEGG分析和聚类热图

研究结论

微生物组和代谢组学结果表明，高比例的直链淀粉/支链淀粉比例能够调节消化和粘膜相关的盲肠微生物群落和代谢特征。三种比例中，喂养含有50%高直链淀粉的饮食具有更好的结果，因为其共生细菌（如Akkermansia，Lactobacillus和Faecalibacterium）的富集，戊酸盐的增加以及促炎细胞因子的减少。代谢组学结果显示盲肠组织的代谢特征发生了改变，包括脂质肉碱和α-生育酚等代谢物的上调和下调。这些发现为直链淀粉/支链淀粉的比例是如何通过调节微生物发酵，导致共生微生物群和代谢物的增殖，从而改善断奶山羊的盲肠环境提供了新的见解。

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本篇文章，检测了喂食不同直链淀粉/支链淀粉比例的山羊的盲肠中SCFAs和炎症因子的变化，并使用16s RNA测序检测了不同组山羊的盲肠粘膜和消化物中微生物的变化，找到了变化的优势菌群以及菌群和SCFAs的相关性。再使用LC-MS/MS非靶代谢组学研究了不同组山羊盲肠组织的代谢物变化。通过多组学结合的方式，揭示了不同比例的直链淀粉/支链淀粉对山羊盲肠环境的影响。

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