前言
2022年3月21日，中山大学附属第一院器官移植中心高伊昉教授及何晓顺教授与暨南大学附属珠海市人民医院吴扬哲教授、尹芝南教授及陆骊工教授等合作，在Clinical and Translational Medicine（IF:11.492）发表了肝细胞癌单细胞测序相关的研究。该篇文章中，中山大学附属第一院何文靖博士与暨大基础医学院胡怡副教授为共同一作，欧易生物提供了该篇文章的单细胞转录组测序和分析工作。
材料：肝脏灌洗液
期刊：Clinical and Translational Medicine
发表时间：2022年3月21日
方法：欧易生物10× Genomics scRNA-seq
研究背景
原发性肝癌以肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）为主。在全球范围内，HCC是导致癌症相关死亡的第四大常见原因，在发病率方面排名第六。鉴于HCC对传统化疗药物易产生治疗抵抗，免疫治疗在HCC中备受期待。γδ T细胞能够特异性靶向肿瘤细胞而不伤及正常细胞的优势特点引起研究者们极大关注，而γδ T细胞浸润的有效性可能与HCC的进展和患者的预后相关。进一步研究观察到，γδ T细胞在HCC中的浸润程度低于肿瘤周围组织。有趣地是，作者还在前期临床研究中发现，Vδ2 T细胞治疗可以显著减缓患者HCC进展。然而，γδ T细胞在HCC肿瘤微环境（Tumor microenvironment, TME）和正常肝组织中的功能差异仍不清楚。因此，为进一步表征和区分浸润性γδ T细胞的免疫异质性图谱，并揭示其功能复杂性和在HCC中的转化演变，作者收集HCC患者以及健康人肝灌洗液进行单细胞测序，为未来治疗HCC免疫疗法提供参考。
内容概述
作者使用磁珠富集来自HCC患者和健康人肝灌洗液中的CD3CD161 T细胞进行单细胞测序，结果发现HCC患者中具有一群表达细胞毒性但接近耗竭状态的γδ T亚群，进一步针对该亚群进行功能富集以及拟时序等分析，发现该亚群LAG3耗竭标记基因以及谷氨酰胺等相关代谢通路显著上调，细胞增殖等相关通路下调，细胞周期停滞在G2/M期。进一步分析该亚群TCR多样性与克隆型，发现相比健康对照组HCC组明显丢失。作者将以上结果与前期实验结果联系，发现来自健康供者的Vδ2 T体外扩增后能够挽救HCC浸润性γδ T细胞的功能和代谢缺失。
研究内容解析
浸润性γδ T细胞聚类及亚型分析
作者首先从HCC患者和健康人肝灌洗液中富集CD3CD161 T细胞，接着针对富集得到的细胞进行单细胞测序(图1A)，并根据TRDC从测序结果中鉴定出γδ T细胞，进一步将γδ T细胞群降维聚类得到6个亚群(图1B)。对γδ T亚群样本来源进行统计分析，发现C4几乎全部来源于HCC患者(图1C)。针对各亚群进行差异分析，发现在top10差异基因中，C4高表达耗竭性标记基因LAG3以及毒性标记基因NKG7、GNLY、GZMB和IFNG，表明该亚群在HCC中具有细胞毒性但接近耗竭的特点。此外，作者发现，C0、C1、C2、C3均主要分布在健康肝脏中，分别表达效应记忆T细胞、效应T细胞、记忆T细胞等标记物，C5仅在健康肝脏中检测到，并且高表达naïve T细胞标记物(图1D, E)。这些结果表明，HCC患者相比于健康人的γδ T细胞亚群其多样性发生丢失。进一步针对各亚群差异基因进行富集分析，发现C4中谷氨酰胺代谢和凋亡通路显著上调，TCR信号转导、中心代谢途径（例如：糖酵解、氧化磷酸化）下调，提示HCC内γδ T 细胞的代谢重编程和效应功能的丢失(图1F, G)。
图1 | 单细胞测序分析HCC和健康肝脏中肿瘤浸润性γδ T细胞
HCC浸润性γδ T细胞TCR多样性发生丢失
根据文献报导，TCR多样性与肿瘤进展呈负相关。作者从单细胞测序结果观察到，与健康肝脏相比，HCC肝脏中TRDC γδ T细胞显著减少(图2A)，TCR（TRGV）多样性明显丢失(图2B)。同时，γδ T细胞TRGV、TRGC、TRDV变体在各亚群中的表达证明了C4中TCR多样性普遍丢失(图2C)。TCR克隆型分析结果表明，C4中超过69%的细胞都只能检测到一个TCR克隆型(图2D)。作者将单细胞结果HCC γδ T与已发表的γδ T细胞分类：Vδ1和Vδ2(分别记为基因集1和基因集2)进行比较，结果发现HCC浸润性γδ T细胞与Vδ1的表达谱更为接近(图2E)。然而，Vδ1和Vδ2总体基因集活性都低于健康组，这表明TCR多样性在HCC中总体丢失。进一步利用激光共聚焦显微镜在HCC和癌旁组织切片中观察浸润性Vδ1和Vδ2 γδ T细胞，同样发现HCC浸润性Vδ2 γδ T细胞减少(图2F)。此外，作者还利用HCC患者和健康人的肝灌洗液，基于Th1、Th2和Th17趋化因子的表达CD183 (CXCR3)和CD196 (CCR6)分析γδ T亚型，流式分析结果表明HCC浸润性γδ T细胞中Th1群体显著减少，意味着细胞毒性功能的丢失(图2G)。前期文献报导，Vδ2表现为毒性(Th1样)亚型，而Vδ1在肿瘤发展中的作用仍存在争议。作者的研究结果表明，在HCC中，γδ T细胞的毒性被削弱，而TCR多样性的丢失可能导致γδ T细胞功能多样性的丢失以及在TME中的应答能力的丢失。
图2 | TCR多样性及克隆型分析
γδ T细胞的发育轨迹
为了分析γδ T的发育轨迹，作者根据naïve T、毒性T以及耗竭T的基因标记物(图3A)，结合γδ T各亚群top10差异基因，发现在拟时序轨迹中，以C5（naïve T）作为起始点，分为两支，其中一支向效应T及记忆T分化，而另一支向C4（耗竭T）分化，与前文得到的结论相符(图3B, C, D)。针对拟时序中的高变基因的表达模式进行分析，发现Cell fate1(即向C4耗竭T转变分支)中耗竭标记基因如LAG3表达逐渐升高。同时对γδ T各亚群的代表基因进行动力学趋势分析，结果发现，C4中的代表性基因LAG3逐渐升高（实线代表Cell fate1，虚线代表Cell fate2）(图3E,F)。以上结果表明，在HCC中，浸润性γδ T逐渐趋向耗竭。
图3 | 拟时序分析γδ T细胞发育轨迹
HCC浸润性γδ T细胞G2/M期受到阻滞
为进一步了解HCC浸润性γδ T细胞多样性丢失是否导致TME中T细胞增殖受限和/或诱导细胞凋亡，作者比较了γδ T各亚群中凋亡相关通路表达情况，结果发现，C4高表达细胞凋亡相关通路，表明C4中的细胞在经历细胞凋亡(图4A)。针对γδ T细胞进行组间GSVA，以及针对C4与其他γδ T亚群进行GSVA分析，分析结果中均发现，T细胞增殖能力下调，而T细胞向Th2，Th17和调节T细胞（Treg）分化的通路上调(图4B)。进一步分析γδ T各亚群的细胞周期发现，C4中接近60%的γδ T细胞处于G2/M期，而其他亚群中的γδ T细胞则主要处于G1期(图4C)。根据文献报导，在调控细胞周期G2/M期的分子中，与GADD45家族蛋白相互作用可能导致G2/M期停滞。因此，作者进一步观察γδ T细胞各亚群以及HCC与健康人中细胞周期相关基因的改变，结果发现，正向调控细胞周期因子例如CCNH和CCND3表达下调，细胞周期停滞相关基因例如GADD45家族以及PCNA上调(图4D)。以上研究结果表明，肿瘤浸润性γδ T细胞G2/M期发生停滞，这可能导致HCC TME受到免疫抑制。
图4 | 细胞各亚群细胞增殖、凋亡和细胞周期相关基因的表达
HCC浸润性γδ T细胞具有细胞毒性，但呈现出末端耗竭状态
作者进一步在转录水平和蛋白水平研究细胞毒性和抑制分子的表达。HCC和健康人中的γδ T细胞表达多种细胞毒性分子和细胞因子基因(图5A)。使用流式细胞术分析健康人外周血与HCC患者外周血中的γδ T细胞，以及健康人和HCC患者浸润性γδ T细胞，实验结果表明，HCC肝脏中γδ T细胞相比健康肝脏中γδ T细胞明显减少，而在两者的外周血中γδ T细胞比例相当(图5B)。此外，无论在浸润性γδ T细胞中还是外周血中，细胞毒性分子(IFN-γ, TNF-α)表达水平没有显著差异，但在HCC肝脏中颗粒酶B表达显著增加(p = .0114)，这与作者上述单细胞测序结果相符(图5B)。同时，作者还针对HCC浸润性γδ T细胞与健康人中的γδ T细胞进行差异分析，从火山图以及热图结果中发现，LAG3在HCC中高表达(图5C, D)，同样在蛋白水平上也进行了验证，得到同样的结论(图5E)。此外，HCC和癌旁组织切片的免疫荧光实验结果表明，所有γδ T细胞(Vδ1和Vδ2)都强表达LAG3(图5F)。同时，免疫荧光结果也表明，在HCC TME中，Vδ2 γδ T细胞数量少于Vδ1+ γδ T细胞。值得注意的是，HCC外周血中γδ T细胞与健康对照组相比，LAG3蛋白表达水平没有上调(图5E)。以上结果提示，LAG3介导HCC TME中浸润性γδ T细胞抑制和耗竭机制。
图5 | γδ T细胞中毒性分子、细胞因子、趋化因子及耗竭相关基因表达
HCC浸润性γδ T细胞代谢行为发生巨大转变
在γδ T细胞亚群富集结果中，发现C4中谷氨酰胺代谢通路显著上调，中心代谢途径下调 (图1F, G)，因此，作者进一步关注HCC TME中γδ T细胞代谢途径的改变。效应T细胞功能相关通路例如糖酵解，氧化磷酸化，脂肪和氨基酸代谢通路显著下调，而谷氨酰胺代谢及其相关通路，如氮、精氨酸和脯氨酸代谢在HCC浸润性γδ T细胞中上调(图6A, cluster 4)。对来自健康人供者中的γδ T细胞体外扩增后进行bulk RNA测序，结果发现关键代谢基因表达模式与来自HCC或者健康肝脏中的单细胞测序数据具有很强的相关性(图6B)。
HCC浸润性γδ T细胞表现为LAG3依赖性功能障碍
上述研究结果发现HCC中LAG3表达显著升高，结合HCC中谷氨酰胺代谢显著上调，作者提出猜想：HCC浸润性γδ T 细胞中过表达LAG3可能会导致效应T细胞代谢表型受到抑制。流式分析评估培养基中缺乏谷氨酰胺对体外扩增的Vδ2 T 细胞效应功能的影响，结果发现LAG3在谷氨酰胺限制状态下，表达明显升高(图6C, F)。此外，在谷氨酰胺缺乏的培养基中观察到IFN-γ和TNF-α表达水平下降(图6C)。作者还使用了transwell培养HCC细胞系与γδ T细胞系，模拟谷氨酰胺在TME中的竞争情况。实验结果发现，在transwell共培养条件下LAG3的表达也上调，与scRNA-seq结果一致(图6D)。同时观察到，在transwell中另两种抑制分子PD1和TIM-3的表达水平也升高(图6D)。作者进一步使用两种谷氨酰胺代谢抑制剂：AAA和CB839，分别抑制谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酰胺酶(GLS1)的活性。流式分析显示AAA抑制γδ T细胞中谷氨酰胺的合成，逆转了谷氨酰胺缺乏培养基中LAG3的表达，用CB839阻断谷氨酰胺整体分解代谢也表现出类似的结果。这意味着在细胞外谷氨酰胺限制条件下，LAG3的表达上调是由于细胞内谷氨酰胺代谢途径上调。TIM-3也观察到了类似的结果，但PD-1没有(图6E)。使用Luminex 34-Plex试剂盒检测细胞因子/趋化因子，结果表明，在体外谷氨酰胺剥夺条件下，促炎因子（包括IFN-γ、MIP1a、MIP1b、IL-8、IL-13和GM-CSF）的表达水平在24h内增加，在72h降低。这些数据说明，γδ T细胞长期暴露于谷氨酰胺缺乏的TME中可能削弱其分泌促炎因子的能力。
图6 | HCC中肿瘤浸润性γδ T细胞(C4)与其他健康肝脏中驻留的γδ T细胞相比，
代谢途径发生转变
体外扩增Vδ2 γδ T细胞挽救HCC浸润性γδ T细胞TCR多样性丢失以及效应功能失调
作者此前的研究证明，从健康供者PBMC中扩增的Vδ2 γδ T细胞对于包括HCC在内的晚期癌症有良好的治疗前景。在前期实验中观察到输注的Vδ2 T细胞能够迅速迁移到肿瘤部位并积累。因此，体外扩增Vδ2 T细胞能否挽救HCC浸润性γδ T细胞TCR多样性丢失以及效应功能失调，是作者十分关注的一点。为了解决这一疑惑，作者对来自三位健康供者PBMCs中扩增得到的Vδ2 T进行单细胞测序(图7A)。针对扩增的Vδ2 T细胞与HCC来源的细胞的TCR多样性进行分析，发现TCR主要富集在扩增的Vδ2 T细胞中(图7B)。进一步针对γδ T细胞进行拟时序分析，发现扩增的Vδ2 T细胞分化轨迹展现出分支结构，这表明其功能和分化的多样性，而在HCC样本中没有观察到这一点(图7C)。细胞代谢GSVA结果显示，与HCC来源的γδ T细胞相比，扩增的Vδ2 T细胞富集了主要代谢途径，如氧化磷酸化、糖酵解和脂肪酸代谢(图7D)。进一步进行GSVA分析比较扩增Vδ2 T细胞与HCC样本中γδ T细胞毒性基因，结果显示，扩增Vδ2 T细胞的细胞毒性评分高于HCC样本(图7E)，这意味着细胞毒性效应功能缺失的潜在互补。最后，基因表达水平显示LAG3主要在HCC浸润性γδ T细胞中表达，而非HCC外周来源的γδ T细胞(图7F)。这些结果表明，体外扩增的Vδ2 γδ T细胞可以挽救HCC浸润性γδ T细胞抗肿瘤功能的缺失，也支持了体外扩增的Vδ2 γδ T细胞治疗HCC的潜力。
图7 | HCC中肿瘤浸润性γδ T细胞(C4)与其他健康肝脏中驻留的γδ T细胞相比，代谢途径发生转变
研究结论
这篇文献的作者通过比较HCC患者和健康人肝灌洗液中的γδ T细胞，发现HCC患者中具有一群独特的γδ T亚群，进一步针对该亚群进行功能富集分析、拟时序分析、细胞周期等分析，发现该亚群LAG3耗竭标记基因以及谷氨酰胺等相关代谢通路显著上调，细胞增殖等相关通路下调，细胞周期停滞在G2/M期。此外，该亚群TCR多样性与克隆型相比健康对照组HCC组明显丢失。通过实验验证，发现谷氨酰胺可能参与LAG3介导的HCC TME免疫抑制，使得HCC中γδ T TCR多样性丢失，导致其功能以及应答能力的丢失。作者还发现来自健康供者的Vδ2 T体外扩增后能够挽救HCC浸润性γδ T细胞的功能和代谢缺失，这为未来HCC免疫治疗提供重要的参考。
参考文献：
1.He W, Hu Y, Chen D, et al. Hepatocellular carcinoma-infiltrating γδ T cells are functionally defected and allogenic Vδ2 γδ T cell can be a promising complement. Clin Transl Med. 2022;12(4):e800. doi:10.1002/ctm2.800
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